TECHNOLOGY Introduction

Introduction to zebrafish technology

它是发育生物学家的得力助手,是医学研究的后起之秀,是环境监测的哨兵,是指示兵,是药物研发的新宠,它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼(zebrafish,Danio rario)。


I、Basic characteristics of zebrafish

        Origin: tropical freshwater fish, native to India, Pakistan, Bangladesh, Nepal and other south Asian countries south of the Himalayas.The adult fish is 3-100px long, slightly spindle-shaped, with a small, slightly pointed head and short snout. The body is long and slender, named for its vertical dark blue and silver stripes like those of zebras.



        Zebrafish are developed by in vitro fertilization and the embryo body is transparent.The embryo develops rapidly. After fertilization, it hatches membrane in about 3 days and eats in about 3 days. It reaches sexual maturity in about 3 months and has a life span of more than 2 years.Zebrafish can lay eggs all year round, and the reproduction cycle is 3-4 days. A pair of adult zebrafish can lay 200-300 eggs at a time, and the fertilization rate is usually above 70%.The breeding temperature is generally 23-31℃, and about 15℃ can still survive. The optimal breeding temperature is between 25-28 ℃, the pH value is between 6.8~7.8, and the hardness is between 2~6.



II、The origin and development of zebrafish as model organism

      1938 年,美国布朗大学 Roosen-Rung 教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。

        1950 年代,美国罗格斯大学 K. Kenneth Hisaoka 教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。

        1972 年,美国俄勒冈大学 George Streisinge 教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。

        1989 年,美国俄勒冈大学 Monte Westerfield 教授出版斑马鱼研究圣经 The Zebrafish Book 第一版。

        1998 年,首个斑马鱼模式生物数据库 ZFIN 成立(http://zfin.org)。

        1998 年,全球第一家斑马鱼药物研发服务外包公司成立。

        2004 年,斑马鱼国际资源中心(ZIRC)在俄勒冈大学成立。

        2011 年,斑马鱼模型和技术研究被列入中国科技部「重大新药创制」专项十二五实施计划。

        2012 年,中国国家斑马鱼资源中心成立。 目前,斑马鱼已经成为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎类模式生物,在发育生物学、遗传学、基础医学、药理学、毒理学、药物研发以及生态环境评价等诸多领域得到了广泛应用。 


III、The advantage of zebrafish as model creatures 

       1、拥有与人相似的组织器官和系统,基因和信号通路与人类高度保守:>87%;生理、发育和代谢与哺乳动物高度相似,美国国立卫生研究院(NIH)将斑马鱼列为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物;


       2、斑马鱼是目前唯一适于高通量药物筛选的脊椎类动物;


       3、个体小(目前唯一适于进行微孔板高通量药物筛选的脊椎类动物)、发育周期短 (24 小时器官便可形成)、实验周期短 (筛选结果在一周内即可得出)、费用低(约为鼠类的 1/10~1/100)、体外受精、透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150~200 枚)以及实验用药量小(为小鼠用药量的 1/100~1/1000)。 

IV、Application of zebrafish in basic research fields: developmental biology, gene function, disease pathogenesis, etc

      1、斑马鱼可应用于发育生物学的细胞谱系分析、突变鉴别、饱和诱变分析、基因转移研究、基因连锁图的构建,其体外受精、胚体透明、细胞分裂快等特点使它比起大小鼠有独特优势。 


      2、基因功能研究:斑马鱼繁殖速度快,能提供足够量的胚胎用于基因筛选;其胚体透明的特点可以一目了然地观察到基因突变后的表型变化。 



      3、疾病发病机制研究:斑马鱼的器官发生、疾病生理、基因组与人类相似度较大,主要信号通路和基因具高度同源性,诸多斑马鱼疾病(如血癌、免疫性系统疾病、感染疾病等)模型已建立,利用斑马鱼的疾病模型来研究治愈人类相关疾病是近年全球热点的科研项目。

 

V、Application of zebrafish in drug research and development 

      斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、费用低等优势,又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高等优点,可以有效弥补体外实验和哺乳类动物实验之间的巨大生物学断层,完善现有药物研发体系。将斑马鱼模型鱼体外实验和哺乳动物实验相结合,可以从整体上缩短药物临床前早期研发的实验周期,降低实验成本,提高实验预测的准确性,进而提高药物研发效率,降低药物研发风险。 

       全球医药巨头辉瑞、罗氏、诺华、葛兰素史克、阿斯利康等都逐渐开始使用斑马鱼技术进行药物筛选研发。

        2009 年,斑马鱼药物毒理学评价技术首次通过 FDA 和 EMA 的 GLP 认证,这标志着斑马鱼模型的安全药理学和毒理学评价结果可以作为正式材料纳入临床试验申报资料。

        2013 年,斑马鱼资料首次用于 CFDA 临床申报,目前,中国使用斑马鱼实验数据申报 CFDA 临床试验批件的新药研发项目已经有 4 项,2 项已经获得批件。 美国食品药品监督管理局(FDA)越来越多地应用斑马鱼对临床前药物进行安全性与毒理性评价,并在其官网介绍其研究成果: 


VI、Application of zebrafish in environmental testing and chemical risk assessment 

      斑马鱼早在 1930 年左右就已经在欧洲用于环境监测。目前 OECD 和 ISO 颁布的使用斑马鱼进行环境毒性测试的相关标准已经有 10 项。

       2007 年,美国环境保护署(EPA)将斑马鱼技术列入其转化毒理学研究项目 ToxCast TM。中国也已经颁布了使用斑马鱼进行环境毒性测试的 10 项相关标准。

       ISO-15088-2008     

       Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs 

       

       OECD 化学品鱼类(斑马鱼)毒性测试标准:     

       OECD 203(1992)Fish acute toxicity test     

       OECD 204(1984)Fish prolonged toxicity test: 14-day study     

       OECD 210(1992)Fish early life-stage toxicity test     

       OECD 305(1996)Bioconcentra-tion: Flowthrough fish test     

       OECD 212(1998)Fish short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages     

       OECD 215(2000)Fish juvenile growth test     

       OECD 229(2009)Fish short-term reproducti-on assay    

       OECD 230(2009)21-Day fish screening assay:A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition     

       OECD 236(2013)Fish Embryo Toxicity (FET) Test  


       中国化学品、环境鱼类(斑马鱼)毒性测试标准:     

       GB/T 13267-1991 水质 物质对淡水鱼 (斑马鱼) 急性毒性测定方法     

       GB/T 21281-2007  危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法     

       GB/T 21858-2008  化学品 生物富集 半静态式鱼类试验     

       GB/T 21800-2008  化学品 生物富集 流水式鱼类试验     

       GB/T 21806-2008  化学品 鱼类幼体生长试验     

       GB/T 21807-2008  化学品 鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒性试     

       GB/T 21808-2008  化学品 鱼类延长毒性 14 天试验     

       GB/T 21814-2008  工业废水的试验方法 鱼类急性毒性试验     

       GB/T 21854-2008  化学品 鱼类早期生活阶段毒性试验     

       GB/T 21858-2008  化学品 生物富集 半静态式鱼类试验     

       GB/T 27861-2011  化学品 鱼类急性毒性试验     

       GB/T 31270.12-2014 化学农药环境安全评价试验准则 第 12 部分:鱼类急性毒性试验     

       GB/T 35517-2017 化学品 鱼类生殖毒性短期试验方法     

       GB/T 35515-2017 化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法

       GB/T 31270.12-2014 化学农药环境安全评价试验准则 第 12 部分:鱼类急性毒性试验 


      近十几年来,随着转基因技术的发展和应用,转基因斑马鱼也逐渐应用于水质监测,其对污染物的作用反应快,可在短时间内调查水污染状况或用于特定污染物的检测。将目标质粒注射到斑马鱼体内,斑马鱼经过筛选得到稳定的转基因品系,通过观察荧光蛋白可以用来快速检测不同的环境污染物: 


      银纳米粒子因其抗菌作用而广泛应用于洗涤剂和废物处理领域,为了研究银纳米粒子对环境和健康的影响,来自新加坡国立大学化学系的研究者用斑马鱼作用模式生物评价了银纳米粒子对斑马鱼的毒性,结果显示银纳米粒子可造成斑马鱼胚胎死亡、体轴异常、脊索扭曲、血流减慢、心包水肿、心律不齐等: 与常规物理和化学检测手段相比,应用斑马鱼进行环境监测和化学品研究能实现快速、高效、灵敏、成本低等优点。 


VII、conclusion 

       斑马鱼作为一种小型脊椎类模式生物,很好地弥补了传统体外细胞学等生物检测方法与哺乳动物实验检测中间的生物学鸿沟,有助于将体外实验结果更好与体内实验结果相结合,提高科学研究的效率和质量。同时,斑马鱼自身独特的生物学特征,也为我们探究和深入理解人体生命奥秘带了极大的便利。相信随着更多新技术、新方法的出现以及相互融合,斑马鱼能够在整个广义的生命科学研究中发挥更大的作用和价值。